2022年9月15日，南方科技大学医院的刘洋课题组在mSystems杂志上在线发表了题为DNA Methyltransferase regulates nitric oxide homeostasis and virulence in a chronically adapted Pseudomonas aeruginosa strain的研究论文（DOI: https://doi.org/10.1128/msystems.00434-22）。该研究系统阐释了一株顽固慢性感染铜绿假单胞菌临床菌株TBCF10839中新型DNA甲基转移酶通过调节以一氧化氮（NO）还原酶为代表的反硝化基因的转录，影响细菌抗吞噬能力的机制。本研究为DNA甲基化、NO解毒和细菌毒力之间的关系提供了新的见解。
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背景介绍及研究概述
DNA甲基化是细菌限制性修饰系统的重要组成部分，可以帮助原核生物抵御外源入侵的基因组，其调控基因表达参与胞内生理过程的机制也日渐引起关注。铜绿假单胞菌是一种机会致病菌，可导致难以治疗的急慢性感染。反硝化能力对于微生物在不同环境胁迫条件下的多样性至关重要，例如细菌感染过程中吞噬细胞可产生一氧化氮（NO），而细菌产生的NO还原酶具有解毒作用。铜绿假单胞菌TBCF10839是一种从囊性纤维化（CF）患者中分离的慢性宿主适应性菌株，具有特殊的抗吞噬能力。本课题鉴定了TBCF10839中的孤儿DNA 甲基转移酶M.PaeTBCFII，发现该甲基转移酶调节以NO还原酶为代表的反硝化基因的转录，并影响细菌的抗吞噬能力。生物信息学分析发现DNA甲基化修饰可能通过影响DNR和RpoN等反式因子的结合来改变关键基因表达。系统发育分析表明M.PaeTBCFII的同源蛋白在多种致病菌中存在。该研究加深了对DNA 甲基转移酶在细菌转录调控中作用的理解，为深入研究表观遗传调控反硝化、毒力和宿主-病原体相互作用的分子机制奠定了基础。
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科学发现
1. SMRT-seq甲基化组及质谱检测酶活实验揭示及鉴定了TBCF10839 中M.PeaTBCFII酶及其识别修饰基序
SMRT-seq测序及甲基化组分析发现铜绿假单胞菌TBCF10839的基因组DNA甲基化修饰是以6mA形式为主，并预测出I型甲基转移酶M.PeaTBCFI和M.PeaTBCFII，及其对应的修饰基序“RCCANNNNNNNTGAR”和 “TRGANNNNNNTGC”（修饰位点以粗体下划线表示）。对ΔpaeTBCFIIM缺失突变体进行了SMRT-seq测序，发现整个基因组中“TRGANNNNNTGC”基序中腺嘌呤甲基化缺失。并通过体内和体外酶活实验验证甲基转移酶M.PeaTBCFII的活性和特异性。
图1 LC-MS/MS实验进行TBCF10839基因组DNA甲基化修饰的定量分析以及甲基转移酶M.PeaTBCFII（CP）的体外酶活分析
2. 转录组数据揭示M.PeaTBCFII酶缺失影响铜绿假单胞菌中以NO还原酶为代表的反硝化基因表达
相比较野生型的TBCF10839，ΔpaeTBCFIIM基因缺失菌株中差异表达基因很多与反硝化过程相关，例如norB、norC和nosR等一系列基因表达下调。TBCF10839中nosR和norB的基因调控区域或编码区有M.PeaTBCFII酶的甲基化位点，推测这些位置的甲基化可能影响了与转录因子Dnr和/或sigma因子RpoN的结合，改变了norB、C等反硝化基因的表达。
图2 M.PeaTBCFII酶缺失菌株中与反硝化相关的差异表达基因以及nos和nor操纵子上甲基化修饰位点和转录因子结合位点预测
3. M.PeaTBCFII酶影响铜绿假单胞菌抵抗巨噬细胞吞噬的能力及毒力
在产NO的RAW 264.7巨噬细胞内的细胞内存活测定显示，基因缺失菌株的存活时间降低，而回补菌株恢复了表型。如果在持续感染期间与NOS（NO合酶）抑制剂L-NMMA一起孵育，则在所有菌株之间未观察到显著差异。在大蜡螟感染测定中观察到基因缺失菌株的毒力有明显的下降。因此推测TBCF10839的甲基转移酶M.PeaTBCFII是通过调控NO还原酶的表达，促进胞内存活，抵抗宿主防御系统，调控细菌的毒性。这是首次报道DNA 甲基转移酶调节以NO还原酶为代表的反硝化基因的转录并影响细菌的抗吞噬能力。
图3 TBCF10839野生型和M.PeaTBCFII（CP）酶缺失菌株在巨噬细胞RAW.264.7中的存活情况以及M.PeaTBCFII（CP）酶对细菌感染大蜡螟毒力的影响分析
4. M.PeaTBCFII酶的同源蛋白在多种细菌中存在
为了在铜绿假单胞菌和其他细菌物种中寻找同源蛋白，将关键M.PeaTBCFII酶的序列进行 NCBI-blastX搜索。结果表明，在假单胞菌属尤其是铜绿假单胞菌中存在较多 M.PeaTBCFII酶的同源蛋白。 许多致病物种当中也存在编码相似的蛋白质的序列，例如弧菌、克雷伯氏菌、埃希氏菌等。此外，在那些具有M.PeaTBCFII酶同源物的假单胞菌菌株的氮代谢基因（例如 nosR、norB）中也发现了M.PeaTBCFII酶的识别基序。该工作也为探索不同条件下铜绿假单胞菌和其他生物反硝化过程的表观遗传调控提供了新的视角。
图4 M.PeaTBCFII酶的系统发育分析以及多序列比对显示10种不同假单胞菌菌株的nosR和norB中M.PeaTBCFII酶的甲基化识别基序
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总结展望
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作者信息
南方科技大学医院刘洋副研究员、南方科技大学医学院杨亮教授为本论文共同通讯作者。本文第一作者韩舒虹是南方科技大学医学院培养的首批硕士，目前为该学院博士研究生。南方科技大学医学院硕士研究生刘继鸿、博士研究生李绵欢、研究助理教授蔡曌、助理教授陈浩等为该工作提供了重要帮助。
因发展需要，研究团队诚邀博士后和研究生加入。
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